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攻克ELISA實驗,你需要搞定這些問題
瀏覽次數:263發布日期:2021-04-28
ELISA是蛋白定量的金標準,也是免疫學研究中常用的實驗方法之一。很多人覺得ELISA很簡單,其實不然。紀寧生物帶你繞開ELISA實驗中出現的各種問題,輕松搞定ELISA實驗~
 
酶聯免疫吸附(ELISA)用于:
(1)免疫酶染色各種細胞內成份的定位;
(2)研究抗酶抗體的合成;
(3)顯現微量的免疫沉淀反應;
(4)定量檢測體液中抗原或抗體成份。
優點:快速、靈敏、定性、定量、定位
 
實驗原理
1.包被:抗原/抗體,固相化
2.反應: 1)待測抗體/抗原; 2)酶標抗原/抗體
3.洗滌:使結合在固相上的抗原抗體復合物與未結合的分離
4.底物顯色:定性/定量分析
 
常用方法
1.間接法
檢測抗體常用的方法, 主要用于對病原體抗體的檢測。
優勢:二抗可以加強信號,而且有多種選擇能做不同的測定分析。不加酶標記的一級抗體則能保留它多的免疫反應性。
缺點:交互反應發生的機率較高
 
2.雙抗體夾心法
檢測大分子抗原常用的方法。
優勢:高靈敏、高專一性,抗原無須事先純化。
缺點:抗原一定得擁有兩個以上的抗體結合部位。
 
3.競爭法
檢測小分子半抗原(藥物、激素等)。
優勢:可適用比較不純的樣本,而且數據再現性很高。
缺點:整體的敏感性和專一性都較差。
 
常見問題分析
 
Q1.標曲不顯色或顯色很弱,樣本顯色
溶解標準品以及倍比稀釋時,未渦旋震蕩或不夠充分。
標準品溶解、倍比稀釋時均需要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復吹打,效率較低、效果也不一定jia。
 
Q2.標曲和樣本均不顯色
在孵育階段靜置在桌面上,這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸,導致顯色偏弱。
推薦孵育階段,使用ELISA的微孔板振蕩器,調至合適的頻率,使抗原抗體充分接觸,保證結合效果。如果排除上述原因,有可能是漏加了某個組分,如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手,一定要做好標記和記錄,或者使用添加染料的ELISA試劑盒。
 
Q3.標曲顯色,樣本不顯色
當樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強,就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度gao的方法,與不同技術結合后,衍生出了多種類型的ELISA,提高了檢測靈敏度。
對于目的蛋白濃度特別低的樣本,可以嘗試用高敏ELISA,但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度,只能說可以提高樣本的可測率,并使結果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低,而高敏ELISA可提高樣本OD值,使之盡量位于標曲范圍內,得到的數值也更加可信。
 
Q4.標曲和樣本都顯色,但復孔的CV大
這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關了。移液器的使用維護不規范,就會造成移液的誤差較大;實驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。
掌握移液器的正確使用和維護。關于個人的操作可練習移液動作、加快速度,確保移液的精密度。
 
Q5.本底偏高,樣本值測不到
標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候,本底過高會掩蓋目的信號,導致無法測到樣本值。
在加入TMB顯色后,需實時觀察標曲顯se情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色,即可終止反應。
 
Q6.樣本經不同梯度稀釋,計算得到的樣本值差異較大
這里涉及到了基質效應。通常血清樣本加樣量較高時,血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸,基質效應較明顯。而經過稀釋后,干擾因素也隨之稀釋,影響就會較小。當某兩個梯度稀釋后,計算得到的樣本值接近時,我們就可以認為在該稀釋梯度時,樣本中的干擾因素影響較小,計算得到的值也是接近真實的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本,經過多倍稀釋后,就更加測不到了,此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。
 
Q7.不同試劑盒中的組分能否通用
除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液,其它組分不建議用其它試劑盒的組分,甚至是同一指標不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標準品、標準品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經過優化的,如果貿然使用其它試劑盒的組分,有可能對結果產生影響。
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